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發(fā)布時(shí)間： 2025-10-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 790次端粒酶活性是細(xì)胞增殖潛能與衰老狀態(tài)的重要標(biāo)志，在癌癥研究、干細(xì)胞生物學(xué)及抗衰老領(lǐng)域具有關(guān)鍵意義。端粒酶活性檢測(cè)試劑盒通過(guò)擴(kuò)增端粒酶延伸的產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的高靈敏度檢測(cè)。為確保端粒酶活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性，掌握科學(xué)、規(guī)范的使用方法至關(guān)重要。
第一步：實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與環(huán)境控制在潔凈、無(wú)核酸污染的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，避免外源DNA或RNase污染。使用專(zhuān)用移液器、槍頭與離心管，建議使用帶濾芯的吸頭。提前將試劑盒各組分從-20℃冰箱取出，冰上融化后輕柔混勻，避免劇烈震蕩。所有試劑使用后立即放回低溫保存。第二步：樣本制備與處理收集待測(cè)細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞），用預(yù)冷PBS洗滌2-3次。采用裂解緩沖液（通常含CHAPS、DTT等）冰上裂解細(xì)胞15-30分鐘，期間輕搖數(shù)次。4℃下12,000×g離心20分鐘，取上清即為端粒酶提取物。蛋白濃度建議調(diào)整至0.1-2μg/μL，分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。第三步：反應(yīng)體系配制按說(shuō)明書(shū)比例配制PCR反應(yīng)混合液，通常包括：端粒酶引物（TS引物）擴(kuò)增引物（CX引物）dNTPsTaq DNA聚合酶緩沖液在冰上操作，逐項(xiàng)加入，輕柔混勻，短暫離心去除氣泡。建議設(shè)置三類(lèi)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照：試劑盒提供的端粒酶陽(yáng)性提取物陰性對(duì)照：熱滅活樣本（85℃加熱10分鐘）空白對(duì)照：以裂解液代替樣本第四步：端粒酶延伸與PCR擴(kuò)增取適量樣本提取物加入反應(yīng)體系，先進(jìn)行延伸反應(yīng)（30℃孵育30分鐘），使端粒酶在TS引物上添加TTAGGG重復(fù)序列。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃變性2分鐘；94℃ 30秒，50-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循環(huán)25-35次；72℃終延伸5分鐘）。第五步：產(chǎn)物檢測(cè)與分析擴(kuò)增完成后，取10-15μL產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或瓊脂糖凝膠電泳。銀染或EB染色后觀察梯狀條帶——每相差6bp形成一條帶，表明端粒酶活性存在。也可使用熒光定量法（qTRAP）進(jìn)行定量分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對(duì)活性。第六步：數(shù)據(jù)記錄與結(jié)果判讀記錄樣本來(lái)源、蛋白濃度、循環(huán)數(shù)及電泳結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈現(xiàn)清晰梯形條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶或極弱，空白對(duì)照無(wú)信號(hào)。樣本條帶強(qiáng)度可半定量反映端粒酶活性水平。
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